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優(yōu)化孢子形成和純化方法用于評估對芽孢桿菌孢子的殺孢效果
2024-09-12 10:36:42
細(xì)菌孢子在環(huán)境中普遍存在，本質(zhì)上能夠抵抗許多極端條件，包括高溫、有毒化學(xué)物質(zhì)、輻射等，這給生產(chǎn)無菌藥品的制藥設(shè)施帶來了重大挑戰(zhàn)。進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測和消毒是確保設(shè)施處于無菌控制狀態(tài)的兩種常見方式，但殺孢子活性很容易受到多種因素的影響，包括消毒劑濃度、細(xì)菌種類、載體表面、接觸時(shí)間和干擾物質(zhì)。由于孢子質(zhì)量低、中和方法無效、接觸時(shí)間不準(zhǔn)確等原因，可能會(huì)觀察到假陽性的殺孢子結(jié)果。在這方面，需要一種標(biāo)準(zhǔn)化的方法來驗(yàn)證藥物配制設(shè)施中消毒劑的有效性，特別是針對高品質(zhì)芽孢桿菌孢子的滴度、純度和抗性。為此推薦本篇文章與大家一起學(xué)習(xí)，希望能對大家有所幫助。
內(nèi)容
1.摘要
驗(yàn)證殺孢子劑的功效是當(dāng)前良好消毒生產(chǎn)規(guī)范中的關(guān)鍵步驟，孢子質(zhì)量差會(huì)導(dǎo)致殺孢子結(jié)果呈假陽性。本研究旨在探索芽孢桿菌孢子的最佳孢子形成和純化方法。在5種不同的孢子形成培養(yǎng)基中產(chǎn)生了7株芽孢桿菌的孢子，密度離心后，用相差顯微鏡和計(jì)數(shù)分析法測量孢子的產(chǎn)量。通過次氯酸鈉殺孢子試驗(yàn)確定了加熱、超聲處理和溶菌酶等純化方法以及成熟對孢子質(zhì)量的影響。在所測試的7種芽孢桿菌菌株中，有4種認(rèn)為DSM是其首選孢子形成培養(yǎng)基。蠟狀芽孢桿菌、球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌在30°C下的孢子形成率高于在37°C下的孢子形成率，地衣芽孢桿菌在 37°C下于MAC中，其孢子形成率比其他培養(yǎng)基高出40-72%。在2xSG中觀察到了蠟狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌形成最大孢子量。所有研究的純化方法都提高了孢子的純度，并隨著菌株的變化而變化。然而，高溫（80°C，持續(xù)20 min）和溶菌酶（100 μg/mL）處理會(huì)使特定芽孢桿菌菌株對次氯酸鈉敏感，從而損害其孢子質(zhì)量。成熟期的長短對芽孢抗性有影響，芽孢桿菌菌株的最佳成熟期為7至21天。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步評估消毒劑的殺芽孢活性奠定基礎(chǔ)。
2.結(jié)果與討論
本研究中使用的孢子形成培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如表1所示
最佳孢子形成培養(yǎng)基
所有測試的芽孢桿菌屬在液體（DSM、2xSG和MAC）培養(yǎng)基中比在固體（TSA和NA）培養(yǎng)基中表現(xiàn)出更強(qiáng)的孢子形成能力。在所有測試的芽孢形成培養(yǎng)基中，DSM是七種測試芽孢桿菌菌株中的四種的首選芽孢形成培養(yǎng)基，包括短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌 （ATCC 19659和ATCC 6051）。此外，短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌（ATCC 19659和ATCC 6051）在DSM中表現(xiàn)出最佳的孢子形成能力，孢子形成率約為 90%。稍低的培養(yǎng)溫度（30°C）可提高蠟狀芽孢桿菌、球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的孢子形成水平，相比之下，地衣芽孢桿菌在30°C 時(shí)幾乎無法產(chǎn)生孢子，它更傾向于在MAC肉湯中形成孢子。在2xSG 中觀察到蠟狀芽孢桿菌 和蘇云金芽孢桿菌的最高孢子形成率（表2）。這些結(jié)果表明，不同的芽孢桿菌菌株產(chǎn)生高質(zhì)量的孢子需要特定的孢子形成液和培養(yǎng)條件。
試驗(yàn)孢子條件判定
在進(jìn)行殺孢子試驗(yàn)之前，應(yīng)評估細(xì)菌孢子的質(zhì)量，包括滴度、純度和對 NaOCl 的抗性。在本研究中，所有經(jīng)密度離心處理的芽孢桿菌孢子（由各自最佳孢子形成培養(yǎng)基產(chǎn)生）的滴度均可達(dá)到約 2-3 × 109 CFU/mL（表 2）。同時(shí)，六種受試芽孢桿菌菌株在密度離心和溶菌酶處理、超聲處理（表3）或加熱處理（圖3）后，孢子純度可達(dá)到約90%。蘇云金芽孢桿菌的最大孢子純度約為68.2%。因此，該菌株可能不適合用作芽孢桿菌的代表性測試生物體進(jìn)行殺孢子試驗(yàn)，因此被排除在我們的進(jìn)一步研究之外。
為了評估孢子的質(zhì)量，在孢子抗性試驗(yàn)中，將孢子懸浮液與1500 ppm NaOCl進(jìn)行不同的接觸時(shí)間。以5000 ppm NaOCl暴露作為陽性對照，以確認(rèn) NaOCl 溶液的有效性。結(jié)果表明，無論孢子類型和載體表面類型如何，在5000 ppm NaOCl中接觸10 min即可濃度減少5 log以上，而1500 ppm NaOCl 可使濃度減少3 log以下。
因此，芽孢桿菌孢子懸浮液是否符合殺孢子試驗(yàn)的資格，應(yīng)視為滿足以下三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：(1) 孢子滴度為 2-3 × 109 CFU/mL；(2) 孢子純度≥90%；(3) 接觸時(shí)間為 10 min時(shí)，對抗5000 ppm NaOCl，菌濃度減少5 log以上；對抗1500 ppm NaOCl ，菌濃度減少3 log以下。
成熟時(shí)間對孢子抗性的影響
對于短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌 (ATCC 19659)，在 4℃下儲(chǔ)存 7-21 天的孢子對 1500 ppm NaOCl 的抵抗力比對照組 (0天) 更高，菌濃度減少小于3 log。但在4℃下儲(chǔ)存28天的孢子對1500 ppm NaOCl敏感，其對數(shù)減少量超過3 log，導(dǎo)致這些孢子不符合殺孢子試驗(yàn)的要求。因此，這兩種菌株的最佳孢子成熟期應(yīng)為7至21天。對于蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、球形芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌 (ATCC 6051)的孢子，成熟后未觀察到不合格現(xiàn)象。與儲(chǔ)存7至21天的孢子相比，儲(chǔ)存28天的孢子對1500 ppm NaOCl 的抗性略有下降（圖 2）。因此，芽孢桿菌孢子的最佳成熟期可能是4℃下7-21天。
純化程序?qū)︽咦訉?/span>NaOCl的抗性的影響
將孢子懸浮液在三種溫度（65℃、70℃ 或 80℃）的水浴中加熱 5、10或20min，然后進(jìn)行NaOCl抗性測定。地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌 (ATCC 6051) 孢子的耐熱性相對其他菌株更高，并且沒有觀察到孢子對 NaOCl 的抗性發(fā)生變化（圖3），80℃加熱 20min是純化這些菌株孢子的最佳熱處理。此外，70℃加熱 20 min是純化蠟狀芽孢桿菌孢子的最佳熱處理，這可以提高孢子純度，而不會(huì)損害孢子對 NaOCl 的抗性。然而，枯草芽孢桿菌 (ATCC 19659) 孢子在 65℃下處理5 min后對1500 ppm NaOCl 的抵抗力顯著降低，這表明熱處理不適用于枯草芽孢桿菌 (ATCC 19659) 孢子的純化。
用濃度為100 μg/mL 的溶菌酶處理短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌(ATCC 6051)孢子后未觀察到不合格。為了避免損害孢子的質(zhì)量，特別是對 1500 ppm NaOCl 的抵抗力，濃度分別為10和1μg/mL 的溶菌酶處理對于純化蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌 (ATCC 19659) 孢子來說是最佳的。
超聲處理顯著提高了球形芽孢桿菌孢子的純度，從78.6%提高到95.5%。超聲處理后，所有測試的芽孢桿菌孢子在 NaOCl 抗性試驗(yàn)中均未出現(xiàn)不合格情況。
總體而言，在評估和比較芽孢桿菌孢子的傳統(tǒng)孢子形成和純化方法時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)：（i）最佳孢子形成培養(yǎng)基因不同的芽孢桿菌菌株而異；（ii）加熱、溶菌酶和超聲處理可以提高孢子的純度，但孢子質(zhì)量可能會(huì)受到影響；（iii）芽孢桿菌菌株的最佳成熟期為7至21天；（iv）建立了孢子質(zhì)量評估方法的標(biāo)準(zhǔn)，并且在研究中對芽孢桿菌孢子效果良好。所有這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步評估消毒劑對芽孢桿菌孢子的殺孢子活性鋪平了道路。
