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無(wú)需厭氧培養(yǎng)條件即可檢測(cè)環(huán)境中艱難梭菌分離株的選擇性培養(yǎng)基
2024-03-29 16:04:39
無(wú)需厭氧培養(yǎng)條件即可檢測(cè)環(huán)境中艱難梭菌分離株的選擇性培養(yǎng)基
受污染的環(huán)境表面是艱難梭菌傳播的一個(gè)重要來(lái)源。許多研究表明，醫(yī)療機(jī)構(gòu)的環(huán)境消毒效果往往不盡如人意。對(duì)檢測(cè)孢子污染有效且簡(jiǎn)單易操作的方法，將有助于通過(guò)識(shí)別環(huán)境污染，并提供一種監(jiān)測(cè)消毒效果的手段，從而為改善環(huán)境消毒做出相應(yīng)干預(yù)措施。商用 PCR 檢測(cè)方法易于使用且廣泛可用，但其靈敏度可能不足以檢測(cè)低水平的環(huán)境污染。傳統(tǒng)培養(yǎng)基的檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)艱難梭菌很敏感，但由于對(duì)厭氧培養(yǎng)條件和微生物學(xué)專業(yè)知識(shí)的要求較高，其實(shí)用性大打折扣。選擇性厭氧肉湯培養(yǎng)預(yù)擴(kuò)增毒素基因?qū)崟r(shí)PCR檢測(cè)為檢測(cè)無(wú)癥狀艱難梭菌污染物提供了一種敏感的方法，這種方法可用于環(huán)境污染的檢測(cè)，但其局限性包括需要厭氧培養(yǎng)條件和PCR檢測(cè)的費(fèi)用。
本研究的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)一種廉價(jià)且易于使用的有效的檢測(cè)方法。因此推薦這篇文章給大家，希望能對(duì)大家有所幫助。
Sensitive and Selective Culture Medium for Detection of Environmental Clostridium difficile Isolates without Requirement for Anaerobic Culture Conditions
內(nèi)容
摘要：有效且易于使用的檢測(cè)艱難梭菌孢子污染的方法將有助于確定環(huán)境蓄水池和監(jiān)測(cè)室內(nèi)消毒的效果?；谂囵B(yǎng)基的檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)艱難梭菌很敏感，但由于需要厭氧培養(yǎng)條件和微生物檢驗(yàn)，其實(shí)用性受到限制。作者改良了一種含有硫代乙醇酸和L-胱氨酸的低成本選擇性肉湯培養(yǎng)基，稱為含硫代乙醇酸和L-胱氨酸的艱難梭菌布魯氏菌肉湯（CDBB-TC），用于檢測(cè)需氧培養(yǎng)條件下環(huán)境標(biāo)本中的艱難梭菌。比較了 CDBB-TC（需氧培養(yǎng)條件下）和 CDBB（厭氧培養(yǎng)條件下）從病房表面采集的拭子中回收艱難梭菌的靈敏度和特異性。CDBB-TC 在回收環(huán)境艱難梭菌方面的靈敏度明顯高于 CDBB（分別為 36/41 [88%] vs 21/41 [51%]；P = 0.006）。艱難梭菌乳膠凝集試驗(yàn)、毒素A和毒素B或谷氨酸脫氫酶酶聯(lián)免疫測(cè)定以及毒素B基因PCR檢測(cè)都是有效的確證試驗(yàn)。在總共 477 份環(huán)境培養(yǎng)物中，根據(jù)培養(yǎng)基呈黃色（陽(yáng)性反應(yīng)），但實(shí)際未發(fā)現(xiàn)艱難梭菌，CDBB-TC與CDBB的特異性分別為 100%（0個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果）和 96%（18個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果）。CDBB的假陽(yáng)性培養(yǎng)是由于在CDBB-TC 中不生長(zhǎng)的厭氧非艱難梭菌的生長(zhǎng)造成的。我們的結(jié)果表明，CDBB-TC 為從環(huán)境樣本中回收艱難梭菌提供了一種靈敏且具有選擇性的培養(yǎng)基，且無(wú)需厭氧培養(yǎng)條件。
結(jié)果與討論
艱難梭菌在CDBB與CDBB-TC中的萌發(fā)和生長(zhǎng)的區(qū)別：
如圖1所示，CDBB-TC和CDBB的艱難梭菌孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)的速率和程度相似（圖1）。根據(jù)對(duì)酒精的敏感性，大約90%的孢子（1 log）在30 min內(nèi)萌發(fā)。
CDBB-TC和CDBB在實(shí)驗(yàn)室的靈敏度和選擇性：
從接種拭子中回收艱難梭菌孢CDBB-TC與CDBB相當(dāng)（圖2）。CDBB-TC和CDBB在接種2 log10 CFU孢子的拭子中一致獲得陽(yáng)性結(jié)果。從接種1 log10 CFU孢子的拭子中獲得陽(yáng)性結(jié)果；9次試驗(yàn)中有3次（33%）CDBB陽(yáng)性，9次試驗(yàn)中有7次（78%）CDBB-TC陽(yáng)性。CDBB陽(yáng)性培養(yǎng)在整個(gè)培養(yǎng)基管中呈黃色，而CDBB-TC陽(yáng)性培養(yǎng)在培養(yǎng)管底部呈
CDBB-TC與CDBB對(duì)從病房表面收集的拭子中回收艱難梭菌的敏感性和特異性：
總共從477個(gè)表面收集了環(huán)境拭子（345個(gè)來(lái)自CDI病房的表面，132個(gè)來(lái)自便攜式設(shè)備）。如圖3所示，41份樣品（9%）的CDBB-TC和CDBB培養(yǎng)物均呈陽(yáng)性：其中16例兩種培養(yǎng)基均為陽(yáng)性，20例僅CDBB-TC為陽(yáng)性，其中5例僅從CDBB中呈陽(yáng)性。對(duì)于一種培養(yǎng)基呈陰性而另一種培養(yǎng)基呈陽(yáng)性的環(huán)境樣本，用艱難梭菌乳膠凝集試驗(yàn)對(duì)陰性樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，谷氨酸脫氫酶和毒素A和B的EIA，毒素B基因的PCR均為陰性。如果以所有艱難梭菌陽(yáng)性培養(yǎng)作為標(biāo)準(zhǔn)，CDBB-TC的敏感性明顯高于CDBB（36/41[88%]vs21/41[51%]；P=0.006），對(duì)于接受其他驗(yàn)證性試驗(yàn)的18份CDBB-TC培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，CDBB-TC管底部的18個(gè)（100%）等分經(jīng)其他確認(rèn)試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性，包括艱難梭菌乳膠凝集，毒素B基因的PCR，以及谷氨酸脫氫酶和毒素A、B的EIA。對(duì)于8個(gè)培養(yǎng)陰性的CDBB試管和8個(gè)培養(yǎng)陰性的CDBB-TC試管，通過(guò)相同的驗(yàn)證試驗(yàn)，試管底部的肉湯均為陰性。
在477個(gè)環(huán)境培養(yǎng)中，基于沒(méi)有艱難梭菌的假陽(yáng)性黃色培養(yǎng)基的CDBB-TC和CDBB的特異性分別為100%（0個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果）和96%（18個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果）（P=0.0001）。18個(gè)CDBB假陽(yáng)性培養(yǎng)可歸因于非艱難梭菌厭氧生物的生長(zhǎng)，而它們沒(méi)有在CDBB-TC的有氧環(huán)境中生長(zhǎng)。
研究了不同pH值下硫代乙醇酸對(duì)艱難梭菌孢子萌發(fā)的影響：
如圖4所示，艱難梭菌孢子在無(wú)菌水中或1 mg/ml硫乙醇酸且pH 5時(shí)最小萌發(fā)（基于1 mg/ml溶菌酶的孢子減少）（P≥0.82）；但是，在pH7.6，在80°C時(shí)，1 mg/ml硫乙醇酸（P＜0.0001）中孢子顯著減少，溶菌酶沒(méi)有進(jìn)一步增強(qiáng)（P=0.74）。
討論：綜合研究報(bào)道及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：pH值為7.6而非pH值為5時(shí)，硫代乙醇酸可以刺激環(huán)境孢子恢復(fù)，溶菌酶提高艱難梭菌從環(huán)境樣品中的回收率。硫代乙醇酸可能使孢子對(duì)溶菌酶活性敏感，可能是通過(guò)破壞二硫鍵和增加溶菌酶對(duì)作用位點(diǎn)的滲透。
含有硫代乙醇酸和L-胱氨酸的肉湯培養(yǎng)基為環(huán)境標(biāo)本提供了一種敏感和更具選擇性的培養(yǎng)方法，而不需要厭氧培養(yǎng)條件。這種培養(yǎng)基很容易制備，且價(jià)格相對(duì)便宜。此外，對(duì)微生物學(xué)專業(yè)知識(shí)的要求，因?yàn)榛陬伾兓年?yáng)性肉湯樣品可以被確認(rèn)為艱難梭菌。
多數(shù)厭氧生物在CDBB上生長(zhǎng)，并導(dǎo)致顏色變?yōu)辄S色。這些生物在有氧條件下培養(yǎng)的CDBB-TC中不生長(zhǎng)，但在厭氧條件下培養(yǎng)的CDBB-TC上生長(zhǎng)，這表明CDBB-TC比CDBB更具有選擇性。
本研究還具有一定的局限性。培養(yǎng)基是定性的，不能對(duì)污染負(fù)荷進(jìn)行評(píng)估。與海綿相比，拭子回收孢子的靈敏度可能會(huì)降低，并且環(huán)境樣本僅從一家機(jī)構(gòu)采集，還需在多個(gè)機(jī)構(gòu)額外進(jìn)行更大規(guī)模的研究。最后只測(cè)試了一種商用實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)方法，不同核擴(kuò)增檢測(cè)方法的靈敏度可能存在差異。
